ИСТОРИЯ ВОПРОСА
В методах терапии на основе емкостно-резистивной передачи электрического тока (CRET) используются неинвазивные электротермические процедуры с воздействием радиочастотными (RF) токами для индуцирования гипертермии в тканях-мишенях. Они успешно применяются для снятия боли [1] и восстановления тканей мышц, сухожилий и суставов [2, 3], а также при лечении онкологических заболеваний [4-6]. В случае CRET-терапии результаты экспериментов in vitro свидетельствуют об их потенциальной применимости в онкологии, поскольку токи CRET частотой 448 кГц могут усиливать действие противоопухолевых агентов на клетки плоскоклеточной карциномы HSC-4 [7]. Хотя до недавнего времени предполагалось, что эффекты от процедур CRET были связаны исключительно с гипертермией, ряд исследований in vitro показал, что субтермические дозы (ΔT < 0,1°C) способны вызывать значительные реакции [8-10]. Воздействие субтермических токов CRET частотой 570 кГц на раковые клетки in vitro приводит к значительному снижению скорости пролиферации клеточной линии гепатокарциномы HepG2 [11]. Как минимум частично такая реакция обусловлена остановкой клеточного цикла в фазах G1 и S за счет электрически индуцированных изменений в экспрессии таких белков клеточного цикла, как p53 и Bcl-2. Та же процедура индуцировала некроз и остановку клеточного цикла в линии нейробластомы человека NB69. На основании вышеизложенного авторы предположили, что эффективность CRET-терапии может объясняться суммированием или наложением эффектов гипертермии и электрически индуцированных клеточных реакций [12]. Если это так, то возможно, что в пределах относительно узкого частотного спектра токов, применяемых при CRET-процедурах, термические эффекты могут не иметь существенных отличий, тогда как тип электрически индуцированной реакции может зависеть от конкретной частоты сигнала [13]. С целью проверки данной гипотезы авторами была проанализирована реакция клеток NB69 на воздействие субтермальных токов с частотой в диапазоне 350-650 кГц. Результаты показывают, что среди протестированных частот только сигнал частотой 448 кГц индуцировал статистически значимые проапоптотические и антипролиферативные эффекты. Исходя из этого, сигнал частотой 448 кГц был выбран для исследования процессов, лежащих в основе цитостатического/цитотоксического воздействия субтермической электростимуляции CRET.
МЕТОДЫ
Клеточная культура. Клетки нейробластомы (линии NB69) высевали в культуральные колбы и выращивали в инкубаторе при 37°C. При слиянии клетки отделяли; часть из них высевали в новую колбу, а оставшиеся клетки высевали в чашки Петри с плотностью 8160 клеток/см2.
Обработка электротоком. Обработку проводили на 4-й день

после посева. Электрический ток подавался парами электродов, подключенных к генератору многочастотных сигналов (350 кГц - 650 кГц) (INDIBA®, Барселона, Испания). Схема стимуляции предусматривала подачу 5-минутных импульсов частотой 350 кГц, 448 кГц, 570 кГц или 650 кГц при субтермической плотности (50 мкА/мм2 ). За каждым импульсом следовал период без стимуляции длительностью либо 0 мин или 25 мин (кратковременные процедуры), либо 3 ч 55 мин с повтором через интервалы общей продолжительностью в 4, 12 или 24 ч (другие процедуры). Одновременно с этим контрольные группы, подвергшиеся имитированному воздействию, оставались необработанными. Проводился постоянный контроль параметров стимуляции, атмосферы и электромагнитных свойств среды внутри инкубаторов.
Окрашивание трипановым синим Жизнеспособность клеток после 24-часовой обработки при каждой из выбранных частот тока оценивали методом селективного окрашивания трипановым синим. На каждой частоте проводилось не менее трех экспериментальных определений.
Проточная цитометрия. После 24-часовой обработки клетки собирали и окрашивали йодидом пропидия. В каждом экспериментальном определении обрабатывали три клеточные суспензии в соответствии с условиями эксперимента. Относительные доли субпопуляций subG0/G1, G1, S и G2/M определяли путем количественного определения содержания ДНК. Для сбора (20 000 событий на выборку) и анализа данных использовалось программное обеспечение CellQuest 3.2.
Иммунофлуоресценция. Экспрессию p-ERK1/2, p-p38, p53, Bax и каспазы-3 в образцах определяли иммунофлуоресцентным методом. В каждом экспериментальном определении выполняли микрофотографирование и анализ 3 покровных стекол на каждую экспериментальную группу. На каждом покровном стекле случайным образом выбирали по двадцать полей микроскопа (800 клеток на поле) и рассчитывали процент иммунореактивных клеток от общего числа клеток. Все анализы проводили в двух определениях и повторяли не менее 3 раз для каждого из анализируемых белков.
Вестерн-блоттинг. p-ERK1/2, p-EGFR, p-JKN, циклин D1, p53, p27 и Bax анализировали в конце соответствующих экспериментальных интервалов. После CRET- или имитационной стимуляции клетки собирали, отделяли белки, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и иммуноокрашивали. Полученные полосы подвергались денситометрическому анализу. Для каждого временного интервала и белка проводилось не менее трех экспериментальных определений.
Ингибирование p-ERK1/2 . В эксперименте использовались три группы: контрольные образцы (C); образцы, обработанные ингибитором p-ERK1/2; и образцы, подвергнутые CRETвоздействию в присутствии ингибитора (PD + CRET). Культуры инкубировали в течение 4 дней и подвергали

соответствующим обработкам в течение 12 или 24 ч, после чего анализировали экспрессию Bax (методом иммуноблоттинга через 12 ч), а также клеточный цикл и скорость апоптоза (методом проточной цитометрии через 24 ч).
Статистический анализ. Все экспериментальные процедуры и анализы проводились вслепую. При анализе данных применялся двухвыборочный непарный t-критерий Стьюдента или многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с поправкой Бонферрони. Различия между` выборками считались статистически значимыми при р < 0,05.РЕЗУЛЬТАТЫ
Изменение жизнеспособности клеток в зависимости от частоты сигнала
Влияние на гибель и жизнеспособность клеток после 24 ч периодического воздействия с выбранными частотами сигнала проиллюстрировано на Рис. 1. Образцы, подвергшиеся воздействию токов частотой 350 или 448 кГц, показали значительное снижение среднего числа живых клеток по сравнению с соответствующими контрольными образцами. На более высоких частотах среднее количество живых клеток оставалось неизменным по сравнению с контрольной группой при частоте 570 кГц или немного, но существенно увеличивалось при 650 кГц. Средний процент гибели клеток (6%) в контрольных образцах значительно увеличивался после воздействия тока частотой 448 кГц (37%) или 570 кГц (18%), тогда как при более высоких или более низких частотах он существенно не изменялся. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что реакция клеток на стимуляцию электрическим током в субтермических дозах нелинейно зависит от частоты сигнала, при этом частота 448 кГц является наиболее эффективной для одновременного вызова цитостатического и цитотоксического эффектов в NB69.
Влияние стимуляции частотой 448 кГц на клеточный цикл Проточная цитометрия выявила значительное увеличение (на 40% по сравнению с контрольной группой) процента апоптотических ядер, представленного пиком subG0/G1. Обработка электротоком также вызвала небольшое (на 8%) снижение доли клеток в фазе G1 по сравнению с контрольной группой.
Воздействие на белки, участвующие в апоптозе Белок-супрессор опухоли р53 способствует остановке роста, апоптозу и старению клеток посредством генов-мишеней, таких как Bax, Bak, Bcl или каспазы [14]. При периодическом воздействии сигнала частотой 448 кГц в течение 12 ч (4 импульса воздействия по 5 мин) или 24 ч (8 импульсов по 5 мин) экспрессия белка р53 значительно увеличивалась по сравнению с контрольной группой, как через 12 ч, так и через 24 ч с начала стимуляции. Этот эффект подтвержден иммунофлуоресцентным методом. По Bax наблюдалось значительное транзиторное увеличение после 12 ч периодического воздействия с последующим возвратом к уровням, эквивалентным наблюдавшимся в контрольной группе, еще через 12 часов обработки. Что касается количества каспаза-3-позитивных клеток, которое, как известно, является очень низким в линии NB69 [15], то в нашей контрольной группе оно составляло менее 3%. Хотя иммуноблот-анализ оказался неэффективным для оценки экспрессии каспазы-3, иммунофлуоресцентный анализ на самом деле выявил значительное увеличение числа клеток каспазы-3+ как через 12 ч (68%), так и через 24 ч после обработки (52%). Необходимо отметить, что анализ изображений через 12 ч после обработки выявил большое количество клеток с цитоплазматической каспазной маркировкой, в то время как через 24 ч число каспаз+ клеток было низким, но их маркировка имела ядерное расположение.
Воздействие на белки, участвующие в пролиферации клеток и контроле клеточного цикла
Образцы, обработанные в течение 12 ч, показали

значительную субэкспрессию белков p27 (23,6%) и циклина D1 (18,17%), оба из которых участвуют в контроле прогрессирования фазы G1. После дополнительных 12 часов периодического воздействия наблюдалась сверхэкспрессия p27 (21,8%) и возврат экспрессии циклина D1 к контрольным уровням. Что касается MAPKs, иммуноблот-анализ показал только значительную сверхэкспрессию p-ERK1/2 (28,2%) на 30 мин обработки (при начальном 5-минутном воздействии плюс 25 мин без воздействия), за чем последовала недоэкспрессия (11,7%) через 4 ч (после второго импульса воздействия) и 12 ч (21,4%). После 24 ч обработки (8 импульсов воздействия) уровни экспрессии p-ERK1/2 не отличались от контрольных. MAPK p38, JNK или мембранный белок EGFR, участвующий в приеме внеклеточных сигналов и в активации пути Ras-ERK [16], не испытали значительных изменений в экспрессии их активных форм после начальных 5 или 30 мин обработки. После 30-минутной экспозиции значительное увеличение (на 10%) наблюдалось в проценте клеток p-ERK1/2+, который в контрольных образцах составлял в среднем 60%. При этом средняя доля клеток p-p38+ через 30 мин (около 50% в контрольной группе) не изменилась. Эти результаты соответствую результатам, полученным методом иммуноблот-анализа. Экспрессия Bax, которая значительно увеличивалась (на 30%) после 12 ч обработки электрическим током, оставалась неизменной как в образцах, обработанных только ингибитором p-ERK1/2, так и в образцах, подвергшихся электростимуляции в присутствии ингибитора. Напротив, скорость апоптоза значительно увеличивалась после 24 ч CRET-воздействия в присутствии ингибитора. После 24 ч CRETвоздействия наблюдалось умеренное снижение количества клеток в S-фазе (4%). При применении в присутствии ингибитора воздействие электрическим током индуцировало увеличение доли клеток в указанной фазе цикла на 17% и значительное уменьшение в фазе G0/G1.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Настоящие результаты подтверждают гипотезу о том, что частота сигнала может быть критическим параметром в клеточном ответе на воздействие радиочастотным током при субтермических плотностях тока (Рис. 1). Действительно, ранее сообщалось об апоптотических реакциях в раковых клетках на воздействие электрических полей частотой 100 кГц - 300 кГц [17, 18], что соответствует повышению доли клеток в фазе subG0/G1, наблюдаемому здесь после воздействия сигнала частотой 448 кГц. Белок р53 обнаруживает потенциальное повреждение молекулы и активирует механизмы восстановления. Если повреждение необратимо, р53 активирует апоптоз [19]. После 12 или 24 ч стимуляции электрическим током наблюдалось значительное увеличение экспрессии р53, указывающее на то, что этот белок обуславливает проапоптотический эффект CRET-воздействия. Белок р53 также действует на такие эффекторы, как каспаза-3, и на такие модуляторы апоптоза, как Bax, сверхэкспрессия которых вызывает проапоптотические эффекты в различных типах клеток. В ответ на сигналы, связанные с гибелью клеток, Bax мигрирует из цитоплазмы в митохондрии, активируя апоптотический каскад

Последующие интервалы воздействия с двумя или четырьмя циклами стимуляции (4 или 12 ч обработки, соответственно) приводили к значительной субэкспрессии p-ERK1/2, тогда как в конце 24-часовой обработки, после 7 циклов воздействия, уровни p-ERK1/2 существенно не отличались. На экспрессию общего ERK1/2 CRET-обработка не повлияла, что указывает на то, что электрический ток воздействует на активацию белка, но не на экспрессию гена или белка. Хотя активация ERK1/2 играет решающую роль в стимулировании пролиферации и выживания клеток, его устойчивая активация может также индуцировать дифференцировку, старение, остановку клеточного цикла и/или апоптоз у ряда видов клеток [24, 25]. Вышеприведенные результаты могут указывать на то, что стимуляция электрическим током вызывает первоначальную активацию ERK1/2, которая сохраняется в течение первых часов обработки. Затем продолжение этой активации ввиду импульсов скрытой стимуляции может вызвать субэкспрессию p-ERK и привести к антипролиферативному эффекту, наблюдаемому в конце 24-часовой обработки (Рис. 2). ERK1/2 являются частью пути Ras-ERK MAPK, который активируется несколькими связанными с рецептором тирозинкиназами, такими как EGFR, FGFR, PDGFR или TrkA/B, которые, в свою очередь, активируются внеклеточными лигандами. Рецептор EGFR, который обнаруживается усиленным в различных опухолях головного мозга [26, 27] и ингибирование которого оказывает антипролиферативное действие в клетках нейробластомы [28], предлагается в качестве потенциальной мишени, чувствительной к электрическим и магнитным полям [29, 30]. Иммуноблот-анализ выявил отсутствие значительного снижения экспрессии рецептора. Возможность того, что путь ERK1/2 MAPK вовлечен в действие CRET-обработки на апоптоз или пролиферацию клеток, была дополнительно исследована с использованием ингибитора p-ERK1/2 PD98059. Результаты показывают, что присутствие ингибитора в течение 12 ч обработки электрическим током блокировало проапоптотический эффект CRET-процедуры, обращая вспять электрически индуцированную стимуляцию экспрессии Bax. Однако это ингибирование может иметь транзиторный характер, на что указывает значительное увеличение числа клеток в фазе subG0/G1, наблюдаемое после 24 ч обработки в присутствии PD98059. Кроме того, ингибитор также блокировал уменьшение числа S-клеток, индуцированных CRET-обработкой, при отдельном введении. Эти результаты служат дополнительным подтверждением гипотезы о том, что путь ERK1/2 может быть вовлечен в антипролиферативные и проапоптотические эффекты CRET-обработки.

ВЫВОДЫ
Приведенные результаты демонстрируют, что частота сигнала может быть критическим параметром в клеточном ответе на воздействие радиочастотным током при субтермической плотности тока и указывают на то, что эффекты CRET-воздействия в NB69 обусловлены изменениями в экспрессии белков, контролирующих клеточный цикл, апоптоз и пролиферацию. Мембранные рецепторы, такие как p-EGFR, могут служить потенциальными исходными мишенями для стимуляции электрическим током, вызывая последующую недоэкспрессию p-ERK1/2 (через 4 и 12 ч), за которой следует антипролиферативный эффект, наблюдаемый через 24 ч. С другой стороны, электрический сигнал может быть обнаружен другими рецепторами, такими как FGFR, PDGFR или TrkA/B, с их активацией или сверхэкспрессией в случае, если они интерпретируют сигнал как митогенный стимул. Это может служить причиной повышения ранней активации p-ERK1/2 (на 30 мин), которая обуславливает последующую субэкспрессию p27 (12 ч). Отсюда периодическое повторение стимуляции электрическим током может приводить к последующей активации таких белков, как р53 (через 12-24 ч), и к запуску проапототического ответа, обусловленного повышенной экспрессией Bax (через 12 ч), каспазы-3 (12-24 ч) и р27 (24 ч). Кроме того, активация или сверхэкспрессия р53 и р27 на более поздних фазах обработки повлияла бы на наблюдаемую субэкспрессию циклина D1, что привело бы к дополнительному антипролиферативному эффекту, индуцируя переход части клеточной популяции в состояние покоя. Хотя полученные результаты не являются достаточным основанием для предложения применения методов лечения CRET у онкологических больных, они могут способствовать усовершенствованию технических решений и повышению безопасности электротермических методов лечения.