АНТИАДИПОГЕННЫЙ ЭФФЕКТ ЭЛЕКТРОСТИМУЛЯЦИИ С ЧАСТОТОЙ 448 кГц В СУБТЕРМАЛЬНЫХ ДОЗАХ В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
HERNANDEZ-BULE ML, MARTINEZ-BOTAS J, TRILLO MA, PAINO CL, UBEDA A. ДОКЛАД ПО МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕДИЦИНЕ МАЙ 2016;13(5):3895-903.
(Автореферат. С оригиналом статьи можно ознакомиться по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4838151/)
(Автореферат. С оригиналом статьи можно ознакомиться по адресу https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4838151/)
ВСТУПЛЕНИЕ
Ожирение – фактор риска, который способствует развитию целого ряда тяжелых заболеваний, в том числе таких как диабет, сердечные патологии, а также различные формы рака (1,2). При анализе различных видов терапии в борьбе с ожирением рассматривался широкий спектр физиотерапевтических процедур, в том числе радиочастотное воздействие (РЧ: 100 кГц-3 ГГц) (3-5). Была подтверждена эффективность воздействия РЧ-полей при лечении, направленном на уменьшение жировой ткани (6-9). Антиадипогенный или липолитический эффект от РЧ-воздействия, зависящего от частоты и мощности сигнала, был подкреплен результатами клинических и лабораторных исследований (10-12). Так, в курсе емкостно-резистивной электротерапии (CRET) исследуемые образцы тканей подвергались нагреванию за счет воздействия импульсов электрического тока частотой 448 кГц. Терапевтические процедуры сопровождались ручным нажимом электродами на участки кожи с тем, чтобы подлежащие исследуемые ткани испытывали одновременно два стимулирующих воздействия: тепловое (вызываемое электрическим током) и механическое (8). При проведении более ранних исследований с емкостно-резистивной электростимуляцией импульсами тока частотой 448 Гц, в ходе которой температура среды повышалась до 42°C, было получено значительное снижение внутриклеточного липидного депо в пре-адипоцитах клеток OP9, дифференцированных в зрелые адипоциты у мыши (13). Полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы о том, что антиадипогенный или липолитический эффект емкостно-резистивной электротерапии достигается благодаря клеточному или тканевому ответу на электрогипертермию. С другой стороны, было установлено, что емкостно-резистивные электростимуляции в диапазоне 448-570 кГц в лабораторных условиях значительно воздействуют на жизненно важные функции клеток, в том числе на регуляцию пролиферации в различных видах клеток человека даже при воздействии электрическим током в субтермальных (без нагрева) дозах (14-19). Данные результаты послужили доказательством того, что, как минимум, на клеточном уровне импульсы тока емкостно-резистивной электротерапии способны оказать электростимулирующее действие независимо от наличия гипертермического эффекта. Таким образом, целью настоящего исследования было определить способность (емкостно-резистивной) электростимуляции с частотой 448 кГц помимо антиадипогенного эффекта, вызываемого гипертермией, (13) также самой по себе или в нормотермических условиях влиять на адипогенную дифференцировку клеток. Настоящее исследование посвящено изучению эффекта от воздействия токов емкостно-резистивной электротерапии с частотой 448 кГц при субтермальной плотности токов при ранней адипогенной дифференцировке стволовых клеток жировой ткани (ADSC). Затем в ходе исследования был проведен анализ молекулярной основы наблюдаемого клеточного (тканевого) ответа. Соответственно, было изучено воздействие токов емкостно-резистивной электротерапии на киназы 1 и 2 митогенактивированной протеинкиназы энзима (MEK1/2), а также на фактор транскрипции - гамма-рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами (PPAR)γ. Следует отметить, что оба этих элемента играют важную роль в регуляции адипогенеза (20-22). Кроме того, поскольку группа рецепторов PPARγ напрямую активирует ряд генов, участвующих в синтезе липидов и (или) накоплении адипоцитов, была проведена оценка действия токов емкостно-резистивной электротерапии на уровни экспрессии выбранных генов в стволовых клетках жировой ткани на начальных этапах адипогенной дифференцировки. Здесь и далее PPARγ относится к экспрессии протеина PPAR, а PPARG - к экспрессии гена PPAR.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клеточная культура. Две главные причины использования в исследовании стволовых клеток жировой ткани человека: 1) они хорошо реагируют на емкостно-резистивную электростимуляцию в субтермальных дозах (15); 2) они служат оптимальной моделью для исследования явлений, задействованных в процессах адипогенеза. Все эксперименты проводились на клетках третьего-седьмого пассажа.
Адипогенная дифференцировка стволовых клеток жировой ткани. После выращивания в чашках Петри в течение 4-х суток культуры инкубировались и выдерживались в среде для адипогенной дифференцировки в течение 2-9 суток с обновлением среды через каждые 3-4 суток. В течение последних 48 часов адипогенной обработки образцы подвергались емкостно-резистивной электростимуляции, либо ложному воздействию. Таким образом, электростимуляция клеток производилась на начальных или промежуточных этапах адипогенной дифференцировки.
Воздействие CRET (емкостно-резистивной электротерапии). Воздействие осуществлялось посредством нескольких пар стерильных электродов из нержавеющей стали, которые крепились внутри всех чашек Петри – как чашек с электростимуляцией, так и чашек с ложным воздействием. Для исследования брались только клетки, выращенные на прямоугольном участке между электродами. Пары электродов последовательно соединялись с генератором сигналов (аппарат INDIBA® производства компании INDIBA SA, Барселона (Испания)). Для имитации воздействия пары электродов, вставленные в контрольные чашки, также соединялись с генератором, но питание на них не подавалось.
Окрашивание масляным красным O и количественная оценка содержания липидов. Для оценки адипогенной дифференциации стволовых клеток жировой ткани проводился подсчет количества жирных кислот, образовавшихся из культур, которые выращивались от 2 до 9 суток в дифференцирующей среде. Полученное количество сравнивалось с количеством в образцах, выдержанных в течение аналогичного срока в базальной среде.
Иммуноблоттинг. Протеины выделялись из культивированных клеток электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и подавались на нитроцеллюлозные мембраны Odyssey®. Мембраны инкубировались в блокирующем буфере с моноклональными антителами к гамма-рецепторам человека, активируемым пролифератором пероксисом (PPARγ), а также с антителами к фосфорилированным (p-)MEK1/2 человека и бета-актину человека. Затем мембраны инкубировались с вторичными антителами LI-COR Odyssey и производилось измерение и оценка интенсивности флуоресценции меток. Антитело к PPARγ дает возможность выявить две изоформы PPARγ , представляющие интерес для настоящего исследования, а именно: PPARγ1 и PPARγ2.
Иммунофлуоресценция. Клетки из культур 3-5 пассажа инкубировались с моноклональными антителами к PPARγ человека и метились флуоресцентно антителами к иммуноглобулину G, конъюгированными с красителем Alexa Fluor 488. Ядра клеток были контрастно окрашены бис-бензимидом.
Количественный метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для образования кДНК из стволовых клеток жировой ткани выделялась тотальная РНК. Проводилась амплификация с помощью количественной ОТ-ПЦР. Проводился анализ кривых плавления, отделение и окрашивание продуктов ПЦР-реакции для подтверждения присутствия одного продукта. Эффективность реакции оценивалась амплификацией последовательного разведения кДНК.
Адипогенная дифференцировка стволовых клеток жировой ткани. После выращивания в чашках Петри в течение 4-х суток культуры инкубировались и выдерживались в среде для адипогенной дифференцировки в течение 2-9 суток с обновлением среды через каждые 3-4 суток. В течение последних 48 часов адипогенной обработки образцы подвергались емкостно-резистивной электростимуляции, либо ложному воздействию. Таким образом, электростимуляция клеток производилась на начальных или промежуточных этапах адипогенной дифференцировки.
Воздействие CRET (емкостно-резистивной электротерапии). Воздействие осуществлялось посредством нескольких пар стерильных электродов из нержавеющей стали, которые крепились внутри всех чашек Петри – как чашек с электростимуляцией, так и чашек с ложным воздействием. Для исследования брались только клетки, выращенные на прямоугольном участке между электродами. Пары электродов последовательно соединялись с генератором сигналов (аппарат INDIBA® производства компании INDIBA SA, Барселона (Испания)). Для имитации воздействия пары электродов, вставленные в контрольные чашки, также соединялись с генератором, но питание на них не подавалось.
Окрашивание масляным красным O и количественная оценка содержания липидов. Для оценки адипогенной дифференциации стволовых клеток жировой ткани проводился подсчет количества жирных кислот, образовавшихся из культур, которые выращивались от 2 до 9 суток в дифференцирующей среде. Полученное количество сравнивалось с количеством в образцах, выдержанных в течение аналогичного срока в базальной среде.
Иммуноблоттинг. Протеины выделялись из культивированных клеток электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и подавались на нитроцеллюлозные мембраны Odyssey®. Мембраны инкубировались в блокирующем буфере с моноклональными антителами к гамма-рецепторам человека, активируемым пролифератором пероксисом (PPARγ), а также с антителами к фосфорилированным (p-)MEK1/2 человека и бета-актину человека. Затем мембраны инкубировались с вторичными антителами LI-COR Odyssey и производилось измерение и оценка интенсивности флуоресценции меток. Антитело к PPARγ дает возможность выявить две изоформы PPARγ , представляющие интерес для настоящего исследования, а именно: PPARγ1 и PPARγ2.
Иммунофлуоресценция. Клетки из культур 3-5 пассажа инкубировались с моноклональными антителами к PPARγ человека и метились флуоресцентно антителами к иммуноглобулину G, конъюгированными с красителем Alexa Fluor 488. Ядра клеток были контрастно окрашены бис-бензимидом.
Количественный метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для образования кДНК из стволовых клеток жировой ткани выделялась тотальная РНК. Проводилась амплификация с помощью количественной ОТ-ПЦР. Проводился анализ кривых плавления, отделение и окрашивание продуктов ПЦР-реакции для подтверждения присутствия одного продукта. Эффективность реакции оценивалась амплификацией последовательного разведения кДНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние CRET (емкостно-резистивной электростимуляции) на содержание липидов. При воздействии емкостно-резистивной электростимуляции на контрольные образцы в течение последних 48 часов инкубации наблюдалось значительное снижение содержания клеточного жира по сравнению с ложным воздействием, в образцах, выращенных в дифференцирующей среде в течение 2 суток (61,32±15,05% ниже контрольных образцов; P<0,05) или 9 суток (8,48±2,37% ниже контрольных образцов; P<0,05).
Влияние CRET (емкостно-резистивной электростимуляции) на экспрессию гамма-рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами (PPARγ). Основываясь на вышеописанных результатах, а также учитывая критически важную роль лиганд-активированного фактора транскрипции PPARγ в метаболизме липидов и дифференцировке адипоцитов, с помощью иммуноблот-анализа проводилась оценка потенциального влияния емкостно-резистивной электростимуляции на экспрессию PPARγ. По образцам, инкубированным в базальной среде, была получена нулевая экспрессия PPARγ как при двухсуточной, так и при девятисуточной инкубации. (Рис. 1). При воздействии емкостно-резистивной электростимуляции в течении первых двух суток дифференцировки какого-либо влияния электростимуляции на повышение экспрессии гамма-рецепторов PPARγ под действием адипогенной среды на наблюдалось. В то же время, на 7-9 сутки электростимуляции наблюдалось значительное снижение экспрессии гамма-рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами, а именно 17% по сравнению с дифференцируемыми контрольными образцами, которые испытывали ложное воздействие.
Влияние CRET (емкостно-резистивной электростимуляции) на содержание липидов. При воздействии емкостно-резистивной электростимуляции на контрольные образцы в течение последних 48 часов инкубации наблюдалось значительное снижение содержания клеточного жира по сравнению с ложным воздействием, в образцах, выращенных в дифференцирующей среде в течение 2 суток (61,32±15,05% ниже контрольных образцов; P<0,05) или 9 суток (8,48±2,37% ниже контрольных образцов; P<0,05).
Влияние CRET (емкостно-резистивной электростимуляции) на экспрессию гамма-рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами (PPARγ). Основываясь на вышеописанных результатах, а также учитывая критически важную роль лиганд-активированного фактора транскрипции PPARγ в метаболизме липидов и дифференцировке адипоцитов, с помощью иммуноблот-анализа проводилась оценка потенциального влияния емкостно-резистивной электростимуляции на экспрессию PPARγ. По образцам, инкубированным в базальной среде, была получена нулевая экспрессия PPARγ как при двухсуточной, так и при девятисуточной инкубации. (Рис. 1). При воздействии емкостно-резистивной электростимуляции в течении первых двух суток дифференцировки какого-либо влияния электростимуляции на повышение экспрессии гамма-рецепторов PPARγ под действием адипогенной среды на наблюдалось. В то же время, на 7-9 сутки электростимуляции наблюдалось значительное снижение экспрессии гамма-рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами, а именно 17% по сравнению с дифференцируемыми контрольными образцами, которые испытывали ложное воздействие.
Рисунок 1.
Денситометрическая оценка иммуноблот-анализа PPARγ (отношение PPARγ к бета-актинам), соответствующая полосам PPARγ1 и PPARγ2. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение по показателям контрольного образца, выращенного в дифференцирующей среде в течение 2 или 9 суток (*: P<0,05). Уровни экспрессии PPARγ в недифференцированных контрольных образцах носили остаточный характер, оценке не подлежали, и соответственно, им было присвоено значение 0. PPAR - рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами; CRET - емкостно-резистивная передача электротока; AD - контрольные образцы, инкубированные в адипогенной среде в течение 2 или 9 суток и подвергнутые ложному воздействию CRET; AD+ CRET - образцы, выращенные в адипогенной среде и подвергнутые воздействию CRET в течение последних 48 ч; ND - образцы, выращенные в базальной, недифференцирующей среде.
Влияние CRET (емкостно-резистивной электростимуляции) на ядерную экспрессию и внутриклеточное расположении гамма-рецепторов PPARγ. Наблюдалось значительное снижение количества клеток, демонстрирующих ядерную экспрессию PPARγ в образцах, испытывающих воздействие емкостно-резистивной электростимуляции, по сравнению с дифференцированными контрольными образцами, испытывающими ложное воздействие, как при 2, так и при 9 сутках инкубации (снижение на 42 и 67%, соответственно; Рис. 2). У образцов с девятидневной дифференцировкой, подвергнутых электростимуляции, методом иммуноокрашивания в подавляющих случаях было выявлено расположение гамма-рецепторов PPARγ в цитоплазме в отличие от преимущественного расположения гамма-рецепторов PPARγ в ядре у дифференцированных контрольных образцов, испытывающих ложное воздействие, а также у недифференцированных клеток. У образцов с двухдневной адипогенной дифференцировкой электростимуляция подобного ответа не вызвала.
Рисунок 2.
Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии PPARγ. К положительным относили только клетки, демонстрирующие ядерные PPARγ-рецепторы. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная погрешность по показателям контрольных образцов, дифференцированных в течение 2 или 9 суток и подвергнутых ложному воздействию емкостно-резистивной электростимуляции (*: P<0,05; **: P<0,01). Условные обозначения те же, что и на Рис. 1.
Влияние CRET (емкостно-резистивной электростимуляции) на экспрессию фосфорилированной митогенактивированной протеинкиназы (p-MEK). Митогенные стимуляторы способны вызвать повышенную ядерную экспрессию MEK1, взаимодействие которой с гамма-рецепторами PPARγ приводит к инактивации и транслокации последних в цитоплазму (20-22). С помощью иммуноблоттинга экспрессии p-MEK была исследована возможность емкостно-резистивной электростимуляции вызывать изменения в экспрессии p-MEK, связанные с наблюдаемой цитоплазматической экспрессией PPARγ. В отсутствии электростимуляции при инкубации в адипогенной среде в течение 2 или 9 суток наблюдалось значительное снижение экспрессии p-MEK (соответственно, на 42 и 35% ниже недифференцированных контрольных образцов, Рис. 3). В дифференцированных культурах емкостно-резистивная электростимуляция вызывала избыточную экспрессию p-MEK по сравнению с контрольными образцами, испытывающими ложное воздействие, (соответственно, 12 и 21% при 2 и 9 сутках воздействия), при этом в образцах, дифференцированных в течение 9 суток, наблюдаемый эффект носил статистически значимый характер.
Рисунок 3.
Результаты денситометрического анализа иммуноблотов p-MEK1/2 (соотношение p-MEK к бета-актину). Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение, приведенного к показателям контрольных образцов, выращенных в дифференцирующей среде в течение 2 или 9 суток и подвергнувшихся ложному воздействию емкостно-резистивной электростимуляции (*P<0,05). Условные обозначения те же, что и на Рис. 1.
Влияние CRET (емкостно-резистивной электростимуляции) на регуляцию генов, участвующих в дифференцировке адипоцитов. При двухдневной или девятидневной инкубации в адипогенной среде наблюдалось значительное увеличение экспрессии мРНК и других отдельно взятых генов, участвующих в накоплении липидов и активации PPARγ. Результаты, представленные на Рис. 4, свидетельствуют о том, что при воздействии в течение двух первых суток дифференцировки емкостно-резистивная электростимуляция не вызывала существенных изменений уровней экспрессии мРНК в исследуемых генах. В то же время, на 7-9 сутки адипогенеза при электростимуляции наблюдалось значительное снижение экспрессии мРНК PPARG1 по сравнению с контрольными образцами, испытывающими ложное воздействие. Емкостно-резистивная электростимуляция также вызвала значительное снижение экспрессии мРНК у генов, расположенных по цепочке дальше PPARG, в том числе у перилипина (18%), ангиопоэтин-подобного белка 4 (ANGPTL) (20%) и синтазы жирных кислот (FASN - 11%)
Рисунок 4.
Анализ эффекта емкостно-резистивной электростимуляции в уровнях экспрессии PPARG1, PPARG2, FABP4, PLIN, ANGPTL4, SREBP1c, SCD и FASN количественным методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение, приведенного к показателям образцов, дифференцированных в течение 2 или 9 суток и подвергнувшихся ложному воздействию емкостно-резистивной электростимуляции (*P<0,05). PPARG - гамма-рецепторы, активируемые пероксисомными пролифераторами; PLIN - перилипин; ANGPTL - ангиопоэтин-подобный; FASN - синтаза жирных кислот. Остальные обозначения те же, что и на Рис. 1.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Стволовые клетки жировой ткани способны к дифференцировке с образованием зрелых адипоцитов. Поскольку известно, что ограничительная диета приводит к снижению размеров, но не количества адипоцитов в жировой ткани, можно предположить, что накопление жира в цитоплазме во время адипогенной дифференцировки является критически важным фактором, способствующим ожирению человека (27). Вследствие этого, экспериментальное исследование эффекта в лечении ожирения, наблюдаемого в адипогенной дифференцировке, способно дать необходимую информацию для оптимизации курса терапии. Так, в ходе ранее проведенных исследований выяснилось, что емкостно-резистивная электростимуляция с частотой 448 кГц в термальных дозах (при нагреве) способствует значительному снижению объема жировых отложений в стромальных клетках OP9 у мыши на поздних стадиях дифференцировки (13). При проведении настоящего исследования воздействие токов емкостно-резистивной электротерапии с частотой 448 кГц вызывало значительное и стабильное уменьшение содержания липидов в стволовых клетках жировой ткани человека на начальных этапах адипогенной дифференцировки. Полученные результаты свидетельствуют о том, что электростимуляция, проведенная одновременно с воздействием теплового стимулятора и механическим давлением во время сеансов CRET (емкостно-резистивной электротерапии), способна вызвать значительное уменьшение количества липидов на поздних стадиях адипогенеза. Кроме того, электростимуляция в субтермальных дозах (без нагрева) может создать антиадипогенный эффект на более ранних этапах адипогенеза.
В рамках настоящего исследования выдвигается гипотеза о том, что ранее антиадипогенное действие субтермального стимулятора является следствием цепочки молекулярных ответов, а не прямым эффектом от «опорожнения» липидных пузырьков (липосом). Для исследования процессов, потенциально задействованных в создании субтермального эффекта, определялись уровни экспрессии по протеину и мРНК у гамма-рецепторов, активируемых пероксисомным пролифератором (PPARγ), которые функционируют в качестве ключевого фактора транскрипции в регуляции адипогенеза. Анализ методом иммуноблоттинга не выявил значительных изменений экспрессии PPARγ у образцов на начальных этапах в сравнении с контрольными образцами. В то же время, в образцах, дифференцированных в течение 9 суток, электростимуляция вызвала значительное уменьшение гамма-рецепторов PPARγ в сравнении с контрольными образцами, подвергнутыми ложному воздействию. С другой стороны, в процессе иммуноблот-анализа выяснилось, что емкостно-резистивная электротерапия способствует значительному снижению количества клеток, проявляющих действие ядерных PPARγ-рецепторов, как в образцах с двухдневной, так в образцах с девятидневной дифференцировкой, при этом в последнем случае (9 суток) гамма-рецепторы PPARγ располагались преимущественно в цитоплазме. Несмотря на недостаточность информации о внутриклеточном распределении, экспериментальные данные указывают на нахождение гамма-рецепторов PPARγ в ядре клеток в фазе G. Очевидное расхождение между ответами, полученными в образцах с двухдневной дифференцировкой, при анализе иммуноблотов и иммунофлуоресцентном анализе можно объяснить тем фактом, что при иммуноблоттинге оценивалось общее количество белков PPARγ вне зависимости от места их нахождения внутри клетки. При иммунофлуоресцентном же анализе напротив оценивалось исключительно количество гамма-рецепторов PPARγ, присутствующих в ядре клетки и выступающих в качестве фактора адипогенной транскрипции. Таким образом, вышеупомянутое расхождение не возникало бы, если бы к электростимуляции были восприимчивы только ядерные, активные белки PPARγ. Полученные результаты в целом согласуются с наблюдаемым снижением количества липидов в стволовых клетках жировой ткани, подвергнутых емкостно-резистивной электростимуляции, и свидетельствуют о том, что подобный эффект может запускаться за счет изменения экспрессии PPARγ под воздействием электрического тока.
Сообщалось, что во время митогенной стимуляции клетки происходит избыточная экспрессия p-MEK, энзима киназы сигнального пути MAPK-ERK1/2, который физически связывается с гамма-рецепторами PPARγ, что приводит к транслокации последних из ядра в цитоплазму (20-22) и не дает гамма-рецепторам PPARγ активировать в генах адипогенный эффект. Чтобы установить вероятность участия подобного механизма в транслокации гамма-рецепторов PPARγ в цитоплазму, наблюдаемой у образцов дифференцированных в течение 9 суток и подвергнутых емкостно-резистивной электростимуляции, был проведен анализ экспрессии p-MEK. В то время, как в недифференцированных образцах иммуноблоттингом была выявлена высокая экспрессия p-MEK, что характерно для пролиферирующих культур, в среде, способствующей дифференцировке, наблюдалась заметно низкая экспрессия p-MEK (Рис. 3). По сравнению с дифференцированными контрольными образцами, испытывающими ложное воздействие, действие емкостно-резистивной электротерапии способствовало избыточной экспрессии p-MEK, хотя эффект и достигал статистической значимости только в культурах с девятидневной дифференцировкой. Полученные результаты свидетельствуют о том, что избыточная экспрессия p-MEK может привести к снижению геномной активности PPARG. Как следствие, сигнал с частотой 448 кГц может восприниматься клеткой как митогенный стимулятор, что в свою очередь приведет к избыточной экспрессии p-MEK. Ранняя активация такого сигнального пути в культурах, проходящих адипогенную дифференцировку, может не вызывать изменения в пролиферации клеток (при этом только при транслокации гамма-рецепторов PPARγ в сторону цитоплазмы) и последующего ухудшения адипогенной дифференцировки. Емкостно-резистивная электростимуляция может вызвать, как минимум, одно негеномное взаимодействие гамма-рецепторов PPARγ с различными партнерами белка, что приведет к альтернативной цитоплазматической передаче сигнала и в свою очередь вызовет частичное подавление ранней адипогенной дифференцировки.
В отношении влияния емкостно-резистивной электростимуляции на экспрессию генов, участвующих в адипогенном метаболизме и дифференцировке, в стволовых клетках жировой ткани, дифференцированных в течение 2 суток и подвергнутых емкостно-резистивной электростимуляции, не было выявлено никаких серьезных изменений. В то же время, в образцах с девятидневной дифференцировкой емкостно-резистивная электростимуляция способствовала снижению экспрессии PPARG1, ANGPTL4, перилипина и FASN, никак при этом существенно не влияя на другие анализируемые гены (Рис. 4). Полученные результаты показали, что емкостно-резистивная электростимуляция не только вызывает снижение белковой экспрессии PPARγ, но и приводит к уменьшению PPARG, что способствует снижению экспрессии у целого ряда генов, для транскрипции которых необходимы белки PPARγ напрямую, как у ANGPTL4 и перилипина, или косвенно, как у FASN (28). Известно, что ANGPTL4 способен вызвать необратимую инактивацию липопротеинлипазы (LPL) (29). В связи с этим, была выдвинута гипотеза, что снижение экспрессии данного гена может привести к увеличению липолитической активности липопротеинлипазы. Перилипин – белок, покрывающий липидные капли, защищая их от действия цитозольной липазы (30), поэтому снижение генной экспрессии перилипина может способствовать мобилизации внутриклеточных резервуаров триглицерида. И наконец, FASN представляет собой мультиэнзимный белок, который в присутствии восстановленного НАДФ катализирует синтез пальмитатов из ацетилкоэнзимов А и малонилкоэнзимов А в длинноцепочные насыщенные жирные кислоты (31). Следовательно, снижение экспрессии FASN под воздействием емкостно-резистивной электростимуляции может также способствовать уменьшению количества внутриклеточных липидов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ухудшение эффекта емкостно-резистивной электростимуляции на начальных адипогенных стадиях под действием электрического тока запускается, по крайней мере частично, недостаточной экспрессией генов, участвующих в регуляции синтеза и мобилизации жирных кислот во время адипогенеза.
В заключение, в емкостно-резистивной электротерапии с частотой 448 кГц задействовано одновременно три стимулятора: электрический, тепловой и механический, которые могут действовать совместно, усиливая эффекты друг друга, в лечении ожирения. Радиочастоты 448 кГц способны сами по себе и в отсутствии сопутствующих тепловых и механических элементов препятствовать синтезу и мобилизации жира на начальных стадиях адипогенеза благодаря, как минимум, активации MEK1/2, уменьшению экспрессии белка PPARγ и снижению уровней генной экспрессии PPARG1, перилипина, ANGPTL4 и синтазы жирных кислот. Не следует при этом сбрасывать со счетов вероятность того, что описанные эффекты также способствовали антиадипогенному действию, оказываемому на зрелые адипоциты тепловым воздействием емкостно-резистивной электростимуляции (13), даже если масштаб подобного влияния еще предстоит выяснить.
В рамках настоящего исследования выдвигается гипотеза о том, что ранее антиадипогенное действие субтермального стимулятора является следствием цепочки молекулярных ответов, а не прямым эффектом от «опорожнения» липидных пузырьков (липосом). Для исследования процессов, потенциально задействованных в создании субтермального эффекта, определялись уровни экспрессии по протеину и мРНК у гамма-рецепторов, активируемых пероксисомным пролифератором (PPARγ), которые функционируют в качестве ключевого фактора транскрипции в регуляции адипогенеза. Анализ методом иммуноблоттинга не выявил значительных изменений экспрессии PPARγ у образцов на начальных этапах в сравнении с контрольными образцами. В то же время, в образцах, дифференцированных в течение 9 суток, электростимуляция вызвала значительное уменьшение гамма-рецепторов PPARγ в сравнении с контрольными образцами, подвергнутыми ложному воздействию. С другой стороны, в процессе иммуноблот-анализа выяснилось, что емкостно-резистивная электротерапия способствует значительному снижению количества клеток, проявляющих действие ядерных PPARγ-рецепторов, как в образцах с двухдневной, так в образцах с девятидневной дифференцировкой, при этом в последнем случае (9 суток) гамма-рецепторы PPARγ располагались преимущественно в цитоплазме. Несмотря на недостаточность информации о внутриклеточном распределении, экспериментальные данные указывают на нахождение гамма-рецепторов PPARγ в ядре клеток в фазе G. Очевидное расхождение между ответами, полученными в образцах с двухдневной дифференцировкой, при анализе иммуноблотов и иммунофлуоресцентном анализе можно объяснить тем фактом, что при иммуноблоттинге оценивалось общее количество белков PPARγ вне зависимости от места их нахождения внутри клетки. При иммунофлуоресцентном же анализе напротив оценивалось исключительно количество гамма-рецепторов PPARγ, присутствующих в ядре клетки и выступающих в качестве фактора адипогенной транскрипции. Таким образом, вышеупомянутое расхождение не возникало бы, если бы к электростимуляции были восприимчивы только ядерные, активные белки PPARγ. Полученные результаты в целом согласуются с наблюдаемым снижением количества липидов в стволовых клетках жировой ткани, подвергнутых емкостно-резистивной электростимуляции, и свидетельствуют о том, что подобный эффект может запускаться за счет изменения экспрессии PPARγ под воздействием электрического тока.
Сообщалось, что во время митогенной стимуляции клетки происходит избыточная экспрессия p-MEK, энзима киназы сигнального пути MAPK-ERK1/2, который физически связывается с гамма-рецепторами PPARγ, что приводит к транслокации последних из ядра в цитоплазму (20-22) и не дает гамма-рецепторам PPARγ активировать в генах адипогенный эффект. Чтобы установить вероятность участия подобного механизма в транслокации гамма-рецепторов PPARγ в цитоплазму, наблюдаемой у образцов дифференцированных в течение 9 суток и подвергнутых емкостно-резистивной электростимуляции, был проведен анализ экспрессии p-MEK. В то время, как в недифференцированных образцах иммуноблоттингом была выявлена высокая экспрессия p-MEK, что характерно для пролиферирующих культур, в среде, способствующей дифференцировке, наблюдалась заметно низкая экспрессия p-MEK (Рис. 3). По сравнению с дифференцированными контрольными образцами, испытывающими ложное воздействие, действие емкостно-резистивной электротерапии способствовало избыточной экспрессии p-MEK, хотя эффект и достигал статистической значимости только в культурах с девятидневной дифференцировкой. Полученные результаты свидетельствуют о том, что избыточная экспрессия p-MEK может привести к снижению геномной активности PPARG. Как следствие, сигнал с частотой 448 кГц может восприниматься клеткой как митогенный стимулятор, что в свою очередь приведет к избыточной экспрессии p-MEK. Ранняя активация такого сигнального пути в культурах, проходящих адипогенную дифференцировку, может не вызывать изменения в пролиферации клеток (при этом только при транслокации гамма-рецепторов PPARγ в сторону цитоплазмы) и последующего ухудшения адипогенной дифференцировки. Емкостно-резистивная электростимуляция может вызвать, как минимум, одно негеномное взаимодействие гамма-рецепторов PPARγ с различными партнерами белка, что приведет к альтернативной цитоплазматической передаче сигнала и в свою очередь вызовет частичное подавление ранней адипогенной дифференцировки.
В отношении влияния емкостно-резистивной электростимуляции на экспрессию генов, участвующих в адипогенном метаболизме и дифференцировке, в стволовых клетках жировой ткани, дифференцированных в течение 2 суток и подвергнутых емкостно-резистивной электростимуляции, не было выявлено никаких серьезных изменений. В то же время, в образцах с девятидневной дифференцировкой емкостно-резистивная электростимуляция способствовала снижению экспрессии PPARG1, ANGPTL4, перилипина и FASN, никак при этом существенно не влияя на другие анализируемые гены (Рис. 4). Полученные результаты показали, что емкостно-резистивная электростимуляция не только вызывает снижение белковой экспрессии PPARγ, но и приводит к уменьшению PPARG, что способствует снижению экспрессии у целого ряда генов, для транскрипции которых необходимы белки PPARγ напрямую, как у ANGPTL4 и перилипина, или косвенно, как у FASN (28). Известно, что ANGPTL4 способен вызвать необратимую инактивацию липопротеинлипазы (LPL) (29). В связи с этим, была выдвинута гипотеза, что снижение экспрессии данного гена может привести к увеличению липолитической активности липопротеинлипазы. Перилипин – белок, покрывающий липидные капли, защищая их от действия цитозольной липазы (30), поэтому снижение генной экспрессии перилипина может способствовать мобилизации внутриклеточных резервуаров триглицерида. И наконец, FASN представляет собой мультиэнзимный белок, который в присутствии восстановленного НАДФ катализирует синтез пальмитатов из ацетилкоэнзимов А и малонилкоэнзимов А в длинноцепочные насыщенные жирные кислоты (31). Следовательно, снижение экспрессии FASN под воздействием емкостно-резистивной электростимуляции может также способствовать уменьшению количества внутриклеточных липидов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ухудшение эффекта емкостно-резистивной электростимуляции на начальных адипогенных стадиях под действием электрического тока запускается, по крайней мере частично, недостаточной экспрессией генов, участвующих в регуляции синтеза и мобилизации жирных кислот во время адипогенеза.
В заключение, в емкостно-резистивной электротерапии с частотой 448 кГц задействовано одновременно три стимулятора: электрический, тепловой и механический, которые могут действовать совместно, усиливая эффекты друг друга, в лечении ожирения. Радиочастоты 448 кГц способны сами по себе и в отсутствии сопутствующих тепловых и механических элементов препятствовать синтезу и мобилизации жира на начальных стадиях адипогенеза благодаря, как минимум, активации MEK1/2, уменьшению экспрессии белка PPARγ и снижению уровней генной экспрессии PPARG1, перилипина, ANGPTL4 и синтазы жирных кислот. Не следует при этом сбрасывать со счетов вероятность того, что описанные эффекты также способствовали антиадипогенному действию, оказываемому на зрелые адипоциты тепловым воздействием емкостно-резистивной электростимуляции (13), даже если масштаб подобного влияния еще предстоит выяснить.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hurt RT, Kulisek C, Buchanan LA and McClave SA: The obesity epidemic: Challenges, health initiatives, and implications for gastroenterologists. Gastroenterol Hepatol (NY) 6: 780 792, 2010.
2. Lavie CJ, Milani RV and Ventura HO: Obesity and cardiovascular disease: Risk factor, paradox, and impact of weight loss. J Am Coll Cardiol 53: 1925 1932, 2009.
3. Abraham MT and Mashkevich G: Monopolar radiofrequency skin tightening. Facial Plast Surg Clin North Am 15: 169 177, 2007.
4. Belenky I, Margulis A, Elman M, Bar Yosef U and Paun SD: Exploring channeling optimized radiofrequency energy: A review of radiofrequency history and applications in esthetic fields. Adv Ther 29: 249 266, 2012.
5. Mulholland RS, Paul MD and Chalfoun C: Noninvasive body contouring with radiofrequency, ultrasound, cryolipolysis, and low level laser therapy. Clin Plast Surg 38: 503 520, 2011.
6. Alexiades Armenakas M, Dover JS and Arndt KA: Unipolar radiofrequency treatment to improve the appearance of cellulite. J Cosmet Laser Ther 10: 148 153, 2008.
7. Brightman L, Weiss E, Chapas AM, Karen J, Hale E, Bernstein L and Ge- ronemus RG: Improvement in arm and post partum abdominal and flank subcutaneous fat deposits and skin laxity using a bipolar radiofrequency, infrared, vacuum and mechanical massage device. Lasers Surg Med 41: 791 798, 2009.
8. Valentim da Silva RM, Barichello PA, Medeiros ML, de Mendonga WC, Dantas JS, Ronzio OA, Froes PM and Galadari H: Effect of capacitive radiofrequency on the fibrosis of patients with cellulite. Dermatol Res Pract 2013: 715829, 2013.
9. Van der Lugt C, Romero C, Ancona D, Al Zarouni M, Perera J and Trelles MA: A multicenter study of cellulite treatment with a variable emission radio frequency system. Dermatol Ther 22: 74 84, 2009.
10. Boisnic S, Divaris M, Nelson AA, Gharavi NM and Lask GP: A clinical and biological evaluation of a novel, noninvasive radiofrequency device for the long term reduction of adipose tissue. Lasers Surg Med 46: 94 103, 2014.
11. Hamida ZH, Comtois AS, Portmann M, Boucher JP and Savard R: Effect of electrical stimulation on lipolysis of human white adipocytes. Appl Physiol Nutr Metab 36: 271 275, 2011.
12. Trelles MA, van der Lugt C, Mordon S, Ribe A and Al Zarouni M: Histological findings in adipocytes when cellulite is treated with a variable emission radiofrequency system. Lasers Med Sci 25: 191 195, 2010.
13. Kato S, Saitoh Y and Miwa N: Repressive effects of a capacitive resistive electric transfer (CRet) hyperthermic apparatus combined with provitamin C on intracellular lipid droplets formation in adipocytes. Int J Hyperthermia 29: 30 37, 2013.
14. Hernandez Bule ML, Cid MA, Trillo MA, Leal J and Ubeda A: Cytostatic response of HepG2 to 0.57 MHz electric currents mediated by changes in cell cycle control proteins. Int J Oncol 37: 1399 1405, 2010.
15. Hernandez Bule ML, Pa^no CL, Trillo MA and Ubeda A: Electric stimulation at 448 kHz promotes proliferation of human mesenchymal stem cells. Cell Physiol Biochem 34: 1741 1755, 2014.
16. Hernandez Bule ML, Roldan E, Matilla J, Trillo MA and Ubeda A: Radiofrequency currents exert cytotoxic effects in NB69 human neuroblastoma cells but not in peripheral blood mononuclear cells. Int J Oncol 41: 1251 1259, 2012.
17. Hernandez Bule ML, Trillo MA, Bazan E, Martinez Pascual MA, Leal J and Ubeda A: Nonthermal levels of electric currents applied in capacitive electric transfer therapy provokes partial cytotoxic effects in human neuroblastoma cultures. Neurocirugia (Astur) 15: 366 371, 2004.
18. Hernandez Bule ML, Trillo MA, Cid MA, Leal J and Ubeda A: In vitro exposure to 0.57 MHz electric currents exerts cytostatic effects in HepG2 human hepatocarcinoma cells. Int J Oncol 30: 583 592, 2007.
19. Hernandez Bule ML, Trillo MA and Ubeda A: Molecular mechanisms underlying antiproliferative and differentiating responses of hepatocarcinoma cells to subthermal electric stimulation. PLoS One 9: e84636, 2014.
20. Burgermeister E, Chuderland D, Hanoch T, Meyer M, Liscovitch M and Seger R: Interaction with MEK causes nuclear export and downregulation of peroxisome proliferator activated receptor gamma. Mol Cell Biol 27: 803 817, 2007.
21. Burgermeister E and Seger R: MAPK kinases as nucleo cytoplasmic shuttles for PPARgamma. Cell Cycle 6: 1539 1548, 2007.
22. Burgermeister E and Seger R: PPARgamma and MEK interactions in cancer. PPAR Res 2008: 309469, 2008.
23. Hollenberg CH and Vost A: Regulation of DNA synthesis in fat cells and stromal elements from rat adipose tissue. J Clin Invest 47: 2485 2498, 1969.
24. Van RL, Bayliss CE and Roncari DA: Cytological and enzymological characterization of adult human adipocyte precursors in culture. J Clin Invest 58: 699 704, 1976.
27. Cristancho AG and Lazar MA: Forming functional fat: A growing understanding of adipocyte differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol 12: 722 734, 2011.
28. Lowe CE, O'Rahilly S and Rochford JJ: Adipogenesis at a glance. J Cell Sci 124: 2681 2686, 2011.
29. Mattijssen F and Kersten S: Regulation of triglyceride metabolism by An- giopoietin like proteins. Biochim Biophys Acta 1821: 782 789, 2012.
30. Brasaemle DL, Subramanian V, Garcia A, Marcinkiewicz A and Rothenberg A: Perilipin A and the control of triacylglycerol metabolism. Mol Cell Bio- chem 326: 15 21, 2009.
31. Jayakumar A, Tai MH, Huang WY, al Feel W, Hsu M, Abu Elheiga L, Chirala SS and Wakil SJ: Human fatty acid synthase: Properties and molecular cloning. Proc Natl Acad Sci USA 92: 8695 8699, 1995
2. Lavie CJ, Milani RV and Ventura HO: Obesity and cardiovascular disease: Risk factor, paradox, and impact of weight loss. J Am Coll Cardiol 53: 1925 1932, 2009.
3. Abraham MT and Mashkevich G: Monopolar radiofrequency skin tightening. Facial Plast Surg Clin North Am 15: 169 177, 2007.
4. Belenky I, Margulis A, Elman M, Bar Yosef U and Paun SD: Exploring channeling optimized radiofrequency energy: A review of radiofrequency history and applications in esthetic fields. Adv Ther 29: 249 266, 2012.
5. Mulholland RS, Paul MD and Chalfoun C: Noninvasive body contouring with radiofrequency, ultrasound, cryolipolysis, and low level laser therapy. Clin Plast Surg 38: 503 520, 2011.
6. Alexiades Armenakas M, Dover JS and Arndt KA: Unipolar radiofrequency treatment to improve the appearance of cellulite. J Cosmet Laser Ther 10: 148 153, 2008.
7. Brightman L, Weiss E, Chapas AM, Karen J, Hale E, Bernstein L and Ge- ronemus RG: Improvement in arm and post partum abdominal and flank subcutaneous fat deposits and skin laxity using a bipolar radiofrequency, infrared, vacuum and mechanical massage device. Lasers Surg Med 41: 791 798, 2009.
8. Valentim da Silva RM, Barichello PA, Medeiros ML, de Mendonga WC, Dantas JS, Ronzio OA, Froes PM and Galadari H: Effect of capacitive radiofrequency on the fibrosis of patients with cellulite. Dermatol Res Pract 2013: 715829, 2013.
9. Van der Lugt C, Romero C, Ancona D, Al Zarouni M, Perera J and Trelles MA: A multicenter study of cellulite treatment with a variable emission radio frequency system. Dermatol Ther 22: 74 84, 2009.
10. Boisnic S, Divaris M, Nelson AA, Gharavi NM and Lask GP: A clinical and biological evaluation of a novel, noninvasive radiofrequency device for the long term reduction of adipose tissue. Lasers Surg Med 46: 94 103, 2014.
11. Hamida ZH, Comtois AS, Portmann M, Boucher JP and Savard R: Effect of electrical stimulation on lipolysis of human white adipocytes. Appl Physiol Nutr Metab 36: 271 275, 2011.
12. Trelles MA, van der Lugt C, Mordon S, Ribe A and Al Zarouni M: Histological findings in adipocytes when cellulite is treated with a variable emission radiofrequency system. Lasers Med Sci 25: 191 195, 2010.
13. Kato S, Saitoh Y and Miwa N: Repressive effects of a capacitive resistive electric transfer (CRet) hyperthermic apparatus combined with provitamin C on intracellular lipid droplets formation in adipocytes. Int J Hyperthermia 29: 30 37, 2013.
14. Hernandez Bule ML, Cid MA, Trillo MA, Leal J and Ubeda A: Cytostatic response of HepG2 to 0.57 MHz electric currents mediated by changes in cell cycle control proteins. Int J Oncol 37: 1399 1405, 2010.
15. Hernandez Bule ML, Pa^no CL, Trillo MA and Ubeda A: Electric stimulation at 448 kHz promotes proliferation of human mesenchymal stem cells. Cell Physiol Biochem 34: 1741 1755, 2014.
16. Hernandez Bule ML, Roldan E, Matilla J, Trillo MA and Ubeda A: Radiofrequency currents exert cytotoxic effects in NB69 human neuroblastoma cells but not in peripheral blood mononuclear cells. Int J Oncol 41: 1251 1259, 2012.
17. Hernandez Bule ML, Trillo MA, Bazan E, Martinez Pascual MA, Leal J and Ubeda A: Nonthermal levels of electric currents applied in capacitive electric transfer therapy provokes partial cytotoxic effects in human neuroblastoma cultures. Neurocirugia (Astur) 15: 366 371, 2004.
18. Hernandez Bule ML, Trillo MA, Cid MA, Leal J and Ubeda A: In vitro exposure to 0.57 MHz electric currents exerts cytostatic effects in HepG2 human hepatocarcinoma cells. Int J Oncol 30: 583 592, 2007.
19. Hernandez Bule ML, Trillo MA and Ubeda A: Molecular mechanisms underlying antiproliferative and differentiating responses of hepatocarcinoma cells to subthermal electric stimulation. PLoS One 9: e84636, 2014.
20. Burgermeister E, Chuderland D, Hanoch T, Meyer M, Liscovitch M and Seger R: Interaction with MEK causes nuclear export and downregulation of peroxisome proliferator activated receptor gamma. Mol Cell Biol 27: 803 817, 2007.
21. Burgermeister E and Seger R: MAPK kinases as nucleo cytoplasmic shuttles for PPARgamma. Cell Cycle 6: 1539 1548, 2007.
22. Burgermeister E and Seger R: PPARgamma and MEK interactions in cancer. PPAR Res 2008: 309469, 2008.
23. Hollenberg CH and Vost A: Regulation of DNA synthesis in fat cells and stromal elements from rat adipose tissue. J Clin Invest 47: 2485 2498, 1969.
24. Van RL, Bayliss CE and Roncari DA: Cytological and enzymological characterization of adult human adipocyte precursors in culture. J Clin Invest 58: 699 704, 1976.
27. Cristancho AG and Lazar MA: Forming functional fat: A growing understanding of adipocyte differentiation. Nat Rev Mol Cell Biol 12: 722 734, 2011.
28. Lowe CE, O'Rahilly S and Rochford JJ: Adipogenesis at a glance. J Cell Sci 124: 2681 2686, 2011.
29. Mattijssen F and Kersten S: Regulation of triglyceride metabolism by An- giopoietin like proteins. Biochim Biophys Acta 1821: 782 789, 2012.
30. Brasaemle DL, Subramanian V, Garcia A, Marcinkiewicz A and Rothenberg A: Perilipin A and the control of triacylglycerol metabolism. Mol Cell Bio- chem 326: 15 21, 2009.
31. Jayakumar A, Tai MH, Huang WY, al Feel W, Hsu M, Abu Elheiga L, Chirala SS and Wakil SJ: Human fatty acid synthase: Properties and molecular cloning. Proc Natl Acad Sci USA 92: 8695 8699, 1995